isolasi plasmid metode LISIS ALKALI

 

ARTIKEL MIKROBIOLOGI

• Prinsip Dasar Teori Menghitung Mikroorganisme Pada Cawan
• Bekerja Tanpa Kontaminasi (Dasar Tehnik Aspetis)
• penentuan sifat gram dengan KOH 3% dan perbandingannya dengan pewarnaan gram
• pentingnya penggambaran morfologi koloni di cawan
• bakteri kontrol harga murah untuk pewarnaan gram
• kunci awal identifikasi bakteri
• tips dan trik teknik plate count
• bagaimana membedakan flagellar movement dengan brownian movement ?

PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

• introduction dan referensi
• BAB 1 pengenalan alat
• BAB 2 media pertumbuhan
• BAB 3 sterilisasi
• BAB 4 isolasi mikroorganisme
• BAB 5 morfologi mikroba
• BAB 6 menentukan jumlah dan ukuran mikroba
• BAB 7 faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroorganisme
• BAB 8 daya kerja antimikorba dan oligodinamik
• BAB 9 aktivitas enzimatis mikroorganisme

TEKNIK DASAR BIOTEKNOLOGI

• isolasi plasmid metode lisis alkali
• isolasi DNA kromosom bakteri
• cara mengestimasi ukuran pita berdasarkan pita marker pada elektroforesis

isolasi plasmid metode LISIS ALKALI

berikut merupakan prosedur isolasi plasmid yang biasa dilakukan dalam praktikum genetika di Lab Genetika Fabio Unsud. beserta penjelasannya. for begginer

PEMANENAN SEL

tahap satu ini ditujukan untuk mendapatkan pelet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya.

# PELEPASAN PLASMID DARI SEL

setelah diberi Lar II, maka seharusnya terdapat lendir pada tutup tube (jika dibuka); Lar I, II, III diusahakan dingin.; setelah diberi Lar III, biasanya akan ada gumpalan putih.

STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ --> mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse. sedangkan glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel dan membuat lingkungan hiperosmotik.

SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) dari Lar II dapat melubangi membran sel karena SDS adalah salah satu jenis deterjen yang mampu mengikat (menyelimuti)protein membran sehingga terpisah dari bilayer lipid. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga mendenaturasi DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut. plasmid juga terdenaturasi, namun yang membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk renaturasi. plasmid dan RNA akan keluar dari pori-pori membran tapi DNA kromosom masih tetap di dalam sel karena terlalu besar untuk keluar.

KAc (Kalium Acetic) (asam) akan menetralkan NaOH sehingga plasmid dapat terenaturasi

PEMISAHAN DAN PEMEKATAN PLASMID

# jika etanol tidak kering, maka dapat mengganggu kerja enzim dan tidak mengendapkan DNA saat dielektroforesis.

penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etamol absolut dingin --> mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol mempresipitasi DNA? : penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan +pada H dan - pada O). atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tsb. atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat membantu membayangkan................

kira2 yang terjadi di dalam tube ......

etanol 70% --> membersihkan lagi dan lebih memekatkan plasmid

hasil setelah dielektroforesis.

referensi : referensi utama adalah Sambrook et.al. (1989), tapi masih ditambah beberapa sumber dari internet untuk penjelasan mekanismenya (maap lupa webnya :P),